慢病毒包裝概述及步驟

慢病毒包裝概述

    目前慢病毒也被廣泛地應用于表達 RNAi 的研究中。

    由于有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的 siRNA 半衰期短，體外合成 siRNA 對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達 siRNA 的載體，然后轉移到細胞內轉錄 siRNA 的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成 siRNA ，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的 siRNA 表達載體中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子來指導 RNA 合成的，這是因為 RNA 聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的 RNA 不會帶 poly A 尾。當 RNA 聚合酶Ⅲ遇到連續 4 個或 5 個 T 時，它指導的轉錄就會停止，在轉錄產物 3' 端形成 1~4 個U 。 U6 和 H1 RNA 啟動子是兩種 RNA 聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉錄區的上游，適合于表達～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 莖環結構（ stem loop ）。在 siRNA 表達載體中，構成 siRNA 的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉錄，然后兩條鏈互補結合形成 siRNA ；也可由載體直接表達小發卡狀 RNA（small hairpin RNA, shRNA），載體包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子和 4 ～ 5 T轉錄終止位點之間的莖環結構序列，轉錄后即可折疊成具有 1~4 個 U 3 ' 突出端的莖環結構，在細胞內進一步加工成 siRNA 。構建載體前通常要通過合成 siRNA 的方法，尋找的 siRNA ，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入 siRNA 表達載體。

     慢病毒載體（ Lentiviral vector ）較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產生表達 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA ，實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。

     慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝 RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。



 

慢病毒包裝作用：

1. 對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為 RNAi，cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。

2. 進行穩轉細胞株的篩選；

3. 為活體動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液；

在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的瞬時表達。

 

慢病毒包裝步驟

     以六孔板中的1孔為例，每個樣品需要1×106個293T細胞。


     1、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質粒和0.5μg表達質粒以及250μl的無血清培養基。輕柔混勻，室溫孵育5min。


     2、取1.5ml滅菌EP管，取9μl 脂質體2000l溶于250μl無血清培養基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。

     3、將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min

     4、用胰酶消化并記數293T細胞。用含血清的培養基重懸細胞。

     5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養基，再加入DNA-脂質體復合物。

     6、將1ml重懸的293T細胞（1×106個細胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育一晚。

     7、移除含有DNA-脂質體復合物的培養基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。

     8、轉染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。

     9、病毒上清-80°C貯存。

     包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。

注意事項：

      1.在慢病毒感染細胞前，為檢測病毒上清培養液內病毒的活性，并確定病毒與轉染細胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉染Hela細胞，然后使用抗體篩選穩定的細胞轉染株，進行計數和數值統計。

      2. 在慢病毒轉染細胞的過程中zui重要的一步是融合，只有一些較小的慢病毒載體才能轉導進細胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉染的限速步驟。